The Home of High Resolution Light Microscopy (HRLM)
LOUISIANA STATE UNIVERSITY HEALTH SCIENCES CENTER
(LSUHSC). New Orleans, Louisiana USA.

La Cuna de Microscopía Optica de Alta Resolución (MOAR)
VETERANS AFFAIRS MEDICAL CENTER (VHANO)
New Orleans, Louisiana USA.

CHAPTER II (Reviewed Jan. 2004)

CAPITULO II (Revisado Ene. 2004)

Authors / Autores: EO.Hoffmann, MD. <ehoffm@lsuhsc.edu >- T. R.Flores, H.T. <tflore@lsuhsc.edu>
Local Navigational Frame

Caja de Navegación Local

Introduction

Methods

Introducción

Métodos

References / Links

Teaching Cases Index

Referencias /Enlaces

Indice Casos Enseñanza.

Microorganisms

Microorganismos

Glomerulopathies

Glomerulopatias

Liver

References

Hígado

Referencias

WHAT IS YOUR DIAGNOSIS?
Each one of the HRLM photographs below has a TEM couterpart. Can you match them and make a diagnosis?
CUAL ES SU DIAGNOSTICO?
Cada una de las fotos por MOAR aquí abajo tiene su contraparte por MET. Puede parearlas y hacer un diagnóstico? .

Meninges HRLM / MOAR 1

Liver HRLM / MOAR 2

Kidney HRLM / MOAR 3

Pancreas HRLM / MOAR 4

TEM / MET 1

TEM / MET 2

TEM / MET 3

TEM / MET 4

For more detail click on the HRLM photographs.

Para mas detalle pulse sobre las fotos para MOAR.

Introduction: Welcome to our page High Resolution Light Microscopy (HRLM) - Transmission Electron Microscopy (TEM). Sub cellular structures in paraffin sections are difficult to visualize in the light microscope due to limitations of the method itself. However, this instrument is capable to resolve structures of 0.2um. This is the size of a mitochondrion or a neuro endocrine granule. The difficulty of visualizing these structures in the light microscope, is not a problem of the microscope, it is a problem of inadequate processing. The use of electron microscopy histotechnology (epoxy histotechnology) preserves tissues with little shrinkage, little distortion and little loss of substance, permitting the visualization of sub cellular diagnostic structures in the light microscope, without the use of special stains. In surgical pathology this permits the full utilization of the resolving power of the light microscope allowing more accurate and faster diagnosis. This we call High Resolution Light Microscopy or HRLM.
If the diagnostic lesions are below the resolving power of the light microscope (0.2um), TEM in directly available from the same epoxy block.

Introducción: Bienvenidos a nuestra página Microscopía Optica de Alta Resolución (MOAR) - Microscopía Electrónica de Transmisión (MET). Estructuras sub celulares son difíciles de ver en los cortes de parafina debido a limitaciones del método mismo. Sin embargo, el microscopio óptico tiene una capacidad para resolver hasta 0.2um. Este es el tamaño de una mitocondria o de un gránulo de neuro secreción. La dificultad para ver éstas estructuras en el microscopio de luz no es debido al microscopio óptico, es debido al procesamiento inadecuado de los tejidos. La aplicación de la histotecnología usada para microscopía electrónica (histotecnología por epoxies) preserva los tejidos sin encogerlos, sin distorsión y sin pérdida de substancia, permitiendo la visualización de lesiones diagnósticas sub celulares sin necesidad de coloraciones especiales. Esto permite en patología quirúrgica, la utilización plena del poder de resolución del microscopio de luz, produciendo diagnósticos más certeros y más rápidos. El método lo llamamos Microscopía Optica de Alta Resolución o MOAR.
Si las lesiones diagnósticas estan por debajo de la resolución del microcópio óptico (o.2um), MET es  posible directamente del mismo bloque de epoxy.

Methods: The biopsies were fixed in paraformaldehyde, post fixed in osmic acid and embedded in epoxy Spurr. The histologic sections 1-2um thick, were stained with Toluidin blue and Basic Fuchsin (TB-BF). With this method the full resolving power of the light microscope can be utilized (0.2um). This we call High Resolution Light Microscopy (HRLM). This is not possible with paraffin sections.
For more details click below 1 or 2:
1. Handlig iopsies for HRLM-TEM.

2. Processing the sample for HRLM-TEM.

Métodos: Las biopsias fueron fijadas en paraformaldehido, post fijadas en ácido ósmico e incluidas en epoxy Spurr. Los cortes histológicos son de 1-2um de espesor, coloreadas con azul de toluidina y fuchsina básica (AT-FB). Con este método se puede utilizar en una forma óptima el poder de resolución del microscopio de luz (0.2um). Esto no es posible con cortes de parafina.
Para mayores detalles pulse abajo 1 o 2.

1. Manejo de la biopsia para MOAR-MET.

2. Procesando la muestra para MOAR-MET.

Uses and limitations for HRLM: HRLM is very useful in Anatomic Pathology where the majority of the diagnosis are made by the recognition of sub cellular structures (kidney, liver, nervous system, endocrine, microorganisms, others). We have replaced paraffin sections with epoxy sections for HRLM in all our renal biopsies with great success. However HRLM sections in diagnostic pathology are difficult to interpret because the diagnostic lesions are difficult to recognize since they have unusual detail and different colors and also because the lack of experience of most Pathologists with sections rich in sub cellular detail not present in the paraffin sections. As far as different colors are concerned, I do agree that colors are different in the sections for HRLM. However, a pathologist that has the expertise to recognize a lesion, probably will recognize it whether is blue, yellow or red. In the same way that an expert in automobiles will recognize different brands of cars regardless of the color. Therefore, the inability to recognize diagnostic features in the sections for HRLM, is not because the different colors, it probably because of ignorance.

Something similar happens with the rich cellular detail seen in the HRLM sections. The experienced pathologists knows of the existence of all the detail in the diagnostic lesions however, it is not used to see them in a single slide because in the paraffin sections these are difficult to see, need special methods, or they are not seen at all. However, for this experienced pathologist, it will take little additional experience to be able to recognize these features. Epoxy sections for HRLM do not reveal new lesions, new diagnostic features. All what they do is making them visible in a single section, taking full advantage of the resolving power of the light microscope (0.2 um) which is not possible with the paraffin sections.

Perhaps the biggest limitation for the use of HRLM is the tradition of more than a century of the paraffin sections and the lack of references and training in HRLM. The need to introduce a new technology in an established Laboratory is also difficult.

Usos y limitaciones en MOAR: MOAR es muy útil en Anatomía Patológica donde la mayoría de los diagnósticos se hacen por el reconocimiento de estructuras sub celulares (riñón, hígado sistema nervioso, endocrino, microorganimos otros). Nosotros hemos reemplazado los cortes de parafina por cortes de epoxy para MOAR para todas nuestras biopsias renales, con mucho éxito. Sin embargo, se debe tener en cuenta que los cortes para MOAR son difíciles de interpretar por que las lesiones diagnosticas tienen diferentes colores y también por la falta de experiencia de la mayoría de los Patólogos que no están acostumbrados a ver el detalle sub celular que no se ve en los cortes de parafina. Estoy de acuerdo que los cortes para MOAR presentan colores diferentes y detalle extraordinario, sin embargo, un Patólogo experto en reconocer lesiones diagnosticas, las reconocerá así estén en azul, amarillo o rojo. De la misma manera que un experto en automóviles reconocerá las diferentes marcas de carros aun que tengan diferentes colores. Por lo tanto el no reconocer una lesión por que es de otro color es probablemente no porque tiene diferente color sino por ignorancia.

Algo similar ocurre con el detalle celular que se ve en los cortes para MOAR. El Patólogo experimentado sabe de la existencia de los detalles en toda lesión diagnostica, pero no esta acostumbrado a verlos en un solo corte, por que en los cortes de parafina son difíciles de ver, necesitan métodos especiales o no se ven del todo. Sin embargo, para este Patólogo experimentado, tomara muy poca experiencia adicional para reconocer todos estos detalles. En los cortes para MOAR no se descubren lesiones nuevas, todo lo que se consigue es hacerlas todas visibles en un mismo corte, aprovechando de la resolución máxima del microscopio de luz (0.2um), lo que no es posible con los cortes de parafina.

Quizás la imitación mas grande es la tradición de mas de un siglo de los cortes de parafina y la falta de referencias y adiestramiento con esta metodología nueva para MOAR. La necesidad de introducir una tecnología nueva en un laboratorio establecido es también dificil.

Uses for Dx TEM: Diagnostic Transmission Electron Microscopy has a well defined place in surgical Pathology. However, its use and correct application is still not very well underastood or widespread. The Society for Ultrastructural Pathology suggests the following indications for the use of DX TEM.

IN TUMOR PATHOLOGY.
General indications:

  • Unclassifiable neoplasms, by light microscopy.
  • Supporting diagnosis from a list of differential diagnosis.
  • Supporting a light microscopic diagnosis.
  • Determination of the primary site in metastatic neoplasms.

 Specific Indications:

  • Clarification of undetermined or poorly differentiated(look alike) neoplasms (carcinoma, malignant melanoma, malignant lymphoma, sarcoma, germ cell neoplasm).
  • Small cell neoplasm in adults or children.
  • Neuroendocrine neoplasms (primary or metastatic).
  • Confirmation or identification of ependymal, neuronal, glial or meningeal differentiation in CNS tumors.
  • Subclassification of sarcoma.

Usos de MET Dx: La microscopía Electrónica de Transmision para Diagnóstico tiene un lugar bien definido en Patología Quirúrgica. Sinembargo su uso correcto y su aplicacion parecen no ser aun bien entendidos o generalizados. La Sociedad de Patologia Ultraestructural, sugiere las indicaciones siguientes para el uso de MET DX.

EN PATOLOGIA TUMORAL.
Indicaciones generales:

  • Neoplasias no clasificables por microscopia de luz.
  • Diagnóstico de soporte en una lista de diagnosticos diferenciales
  • En apoyo a un diagnóstico por microsocpia de luz.
  • Determinacion del primario en neoplasmas metastaticos.

Indicaciones específicas:

  • Clasificación de noplasias pobremente diferenciadas o similares (carcinoma, linfoma, melanoma, sarcoma, neoplasia de celulas germinales).
  • Neoplasias de celeulas pequeñas en niños y adultos.
  • Neoplasias neuroendocrinas (Primarias o metastaticas).
  • Confirmacion o identificacion de diferenciacion ependimal, neuronal, glial o meningea en tumores del SNC.

Subclasificacion de los sarcomas.

INDICATIONS IN NON-NEOPLASTIC DISEASES:

  • Medical diseases of the kidney.
  • Metabolic storage diseases.
  • Other congenital disorders.
  • Infectious agents.
  • Autoimmune diseases.
  • Certain cutaneous diseases.

Identification of foreign material in tissues.

INDICACIONES EN ENFERMEDADES NO NEOPLASICAS:

  • Enfermedades médicas del riñón.
  • Enfermedades metabólicas de depósito.
  • Otras enfermedades congénitas.
  • Agentes infecciosos.
  • Enfermedades por autoinmunidad.
  • Ciertas enfermedades cutaneas.

Identificación de material extraño en tejidos.

We believe that TEM should be used when the diagnostic features of the problem case are structures and are smaller that the resolving capabilities (power) of the Light Microscope (LM) (0.2 um). With paraffin sections this power is reduced approximately to 2.0 um.

Nosotros creemos que MET se debe usar cuando la facción diagnóstica es una estructura y es mas pequeña que el poder de resolución del microscopio de luz (ML) (0.2 um). En los cortes de parafina este poder se reduce aproximadamente a 2.0 um.

Limitations for DX TEM:
  • Sampling problems.
  • Paucity of truly specific ultrastructural features in tumor pathology.
  • Misinterpretation of entraped structures in tumor pathology.
  • Lack of familiarity of the Surgical Pathologist on TEM uses and limitations.
  • Lack of familiarity of the Surgical Pathologist with the resolving power of the microscopes.
  • Dx TEM is out of the direct control of the Sugical Pathologist.
  • Self seclusion of Pathologists performing Dx TEM.
  • Abuses on the use of TEM. Search of diagnostic structures well within resolving power of the LM.
  • Use of Dx TEM to compensate deficiencies of routine paraffin histotechnology.
  • Relative high cost of TEM methods.
  • Unnecessary delays in reporting results (> 24 Hs).
  • Lack of familiarity of the Levels of Biological Organization and their methods.

Limitaciones de MET DX
  • Problemas de muestreo.
  • Escacés de facciones estructurales específicas en Patología Tumoral.
  • Mala interpretacion de estructuras atrapadas en Patología Tumoral.
  • Poca familiaridad del Patólogo Quirúrgico con los usos y limitaciones de MET Dx.
  • Poca familiaridad del Patólogo Quirúrgico con los poderes de resolución de los microscopios.
  • Estudio especializado que esta fuera del control del Patólogo Quirúrgico.
  • Auto-seclusión del grupo de Patólogos que hacen MET Dx.
  • Abusos del MET. Búsqueda de estructuras por encima del poder de resolución del ML.
  • Uso de Dx MET para compensar las deficiencias de la histotecnología por parafina hecha de rutina.
  • Costo relativamente elevado del MET.
  • Retrasos innecesarios para informar resultados (> 24 hs).
  • Desconocimiento de los Niveles de Organizacion Biologica y sus métodos.
Levels of biological organization and methods.

Each level of biological organization has specific characteristics that may be studied by specialized methods. These methods may have little or no applications at other levels (Dr. Ruy Perez-Tamayo).

  • Molecules (DNA,RNA) - Molecular biology methods.
  • Particles, substances, antigens - Histochemistry, Immunohistochemistry.
  • Cell organelles (subcellular structures) - HRLM, TEM.
  • Cells, tissues - LM, HRLM.
  • Organs, Individuals - Direct observation.
    Resolving power of human eye, LM, FM and TEM
  • Human eye: 0.2mm.
  • Light Microscope: 0.2um.
  • Paraffin LM: 2.0 um.
  • HRLM LM: 0.2um.
  • Fluorescent Microscope: 0.1um.
  • TEM: RP: 0.2nm.

Niveles de organizacion biologica y metodos.

Cada nivel de organización biológica tiene características específicas que pueden estudiarse por métodos especializados. Estos métodos pueden tener poca o ninguna aplicación a otros niveles (Dr. Ruy Perez Tamayo)

  • Moléculas (DNA, RNA) - Métodos de Biologia molecular.
  • Partículas, substancias, antigenos - Histoquímica, Inmunohistoquímica.
  • Organelas celulares (estructuras subcelulares) - MOAR, MET.
  • Células, tejidos - MOAR, LM.
  • Organos, individuos - Observación directa.
Poder de rosolución del ojo humano, ML, MF y MET:
  • Ojo humano: 0.2 mm.
  • Microscopio de luz: 0.2 um.
  • Parafina ML: 2.0 um.
  • MOAR ML: 0.2 um.
  • Microscopio Fluorescente: 0.1 um.
  • MET: 0.2 nm.
REFERENCES REFERENCIAS